【摘要】  　　目的 研究3種不同形貌氧化鋅（ZnO）對(duì)復(fù)合樹(shù)脂抗菌性能的影響。方法 液體稀釋法測(cè)試納米級(jí)ZnO粉、四針狀氧化鋅晶須（T-ZnOw）和微米級(jí)ZnO粉對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。然后按5％的比例分別將3種ZnO添加于化學(xué)固化型復(fù)合樹(shù)脂粉劑中，用薄膜覆蓋法測(cè)定老化處理前后樹(shù)脂的抗菌率，并比較其差異。結(jié)果 納米級(jí)ZnO粉、T-ZnOw和微米級(jí)ZnO粉的MIC分別為78.13、312.50、1 250.00 μg/mL；MBC分別為156.25、625.00、1 250.00 μg/mL。添加了納米級(jí)ZnO粉、T-ZnOw和微米級(jí)ZnO粉的復(fù)合樹(shù)脂老化處理前的抗菌率分別為（93.58±5.95）％、（89.42±4.11）％、（78.97±3.90）％；老化處理后的抗菌率分別為（89.01±7.91）％、（84.63±4.72）％、（72.27±3.89）％。結(jié)論 添加3種不同形貌的ZnO均能增強(qiáng)復(fù)合樹(shù)脂的抗菌活性，其中納米級(jí)ZnO的抗菌性最強(qiáng)，微米級(jí)ZnO最弱，而T-ZnOw在比表面積較小的情況下仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用。

【關(guān)鍵詞】  復(fù)合樹(shù)脂 四針狀氧化鋅晶須 氧化鋅 變異鏈球菌

Effects of three different zinc oxide incorporation on the antibacterial activity against Streptococcus mutans of omposite resin  NIU Li-na1, CHEN Ji-hua1, FANG Ming1, YANG Ju-cai1, XIAO Yu-hong1, NI Feng2. （1. Dept. of Prosthodontics, College of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China; 2. Dept. of Stomatology, PLA Organ Hospital of Nanjing Military Region, Nanjing 210016, China）

[Abstract]  Objective  To investigate the effects of incorporating three different zinc oxide（ZnO） on the antibac-terial activity of composite resin. Methods  The minimal inhibitory concentration（MIC） and minimal bactericidal concentration（MBC） of nano-ZnO, tetrapod-like zinc oxide whiskers（T-ZnOw）, micro-ZnO against Streptococcus mutans were examined by the broth dilution test. Then the three different ZnO were added to the powder of one kind of bicomponent self-cured composite resin at 5% respectively, and the antibacterial activities of the resin specimens were evaluated using the membrane covering method before and after 3-month accelerating aging. Results  The MIC values of the three different ZnO against Streptococcus mutans were 78.13, 312.50 and 1 250.00 μg/mL respectively and the MBC values were 156.25, 625.00, 1 250.00 μg/mL respectively. The antibacterial ratios of the resin specimens incorporating with 5% of the three different ZnO were （93.58±5.95）％, （89.42±4.11）％ and （78.97±3.90）％ respectively, while after 3-month accelerating aging those were （89.01±7.91）％, （84.63±4.72）％ and （72.27±3.89）％. Conclusion  The three different ZnO could improve the antibacterial activity of the composite resin. The nano-ZnO exhibit the strongest antibacterial activity, while the micro-ZnO weakest. The T-ZnOw presents comparatively strong antibacterial activity although with smaller specific surface area.

[Key words]  composite resin； tetrapod-like zinc oxide whiskers； zinc oxide； Streptococcus mutans

復(fù)合樹(shù)脂由于眾多的優(yōu)越性而在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，但是因其聚合收縮而引發(fā)的微滲漏及繼發(fā)齲問(wèn)題仍未能得到根本解決[1]。學(xué)者們嘗試將各種抗菌劑如季銨鹽、洗必泰[2]、載銀抗菌劑[3]等添加到復(fù)合樹(shù)脂中，取得了一定的抗菌效果，但還是存在如抗菌壽命短、變色、機(jī)械性能下等問(wèn)題。近期有報(bào)道指出氧化鈣、氧化鎂、氧化鋅（zinc oxide，ZnO）具有較強(qiáng)的抗菌性，其中ZnO具有更多優(yōu)點(diǎn)：在中性環(huán)境中無(wú)需光照即表現(xiàn)出顯著的抗菌性，顏色和化學(xué)穩(wěn)定性好，同時(shí)鋅還是一種人體所必需的礦物元素[4]。本實(shí)驗(yàn)擬將3種不同形貌的ZnO，即納

米級(jí)ZnO粉、四針狀氧化鋅晶須（tetrapod－like zincoxide whiskers，T-ZnOw）、微米級(jí)ZnO粉添加到化學(xué)固化型復(fù)合樹(shù)脂中，研究其對(duì)復(fù)合樹(shù)脂抗菌性能的影響。

1  材料和方法

1.1  材料和儀器

T-ZnOw（成都交大晶宇科技有限公司），納米級(jí)ZnO粉、微米級(jí)ZnO粉（陜西省師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院），化學(xué)固化型復(fù)合樹(shù)脂（粉液型）由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔材料實(shí)驗(yàn)室提供，變異鏈球菌ATCC 25175由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，比表面積測(cè)試儀（北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司），腦心浸出液（brain-heart infusion，BHI）（Sigma公司，美國(guó)），人工唾液（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科），聚乙烯薄膜（Interscience公司，法國(guó)）。

1.2  最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的檢測(cè) 

將3種ZnO粉用無(wú)菌BHI液體培養(yǎng)基按二倍稀釋法制成10個(gè)濃度梯度的抗菌劑應(yīng)用液。將傳代培養(yǎng)的變異鏈球菌ATCC 25175配制成1.5×107 CFU/mL的菌懸液。每個(gè)試管中加入抗菌劑應(yīng)用液1 mL、菌液100 μL及無(wú)菌BHI液體培養(yǎng)基900 μL后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24～48 h。試管內(nèi)液體清亮的抗菌劑最低濃度為該抗菌劑的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。接種環(huán)挑取清亮試管中的培養(yǎng)物，劃線接種于BHI瓊脂平板上，孵育48 h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌劑濃度為該抗菌劑的最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）。重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照即不加實(shí)驗(yàn)藥液，只加入等量的BHI培養(yǎng)液和稀釋后的菌懸液；陰性對(duì)照即只加入等量的實(shí)驗(yàn)藥液和BHI培養(yǎng)液而不加菌懸液。

1.3  樹(shù)脂抗菌率的檢測(cè)

1.3.1  樣本的制備  按5％的添加比將3種不同形貌的ZnO分別加于復(fù)合樹(shù)脂中作為實(shí)驗(yàn)組，未添加ZnO的復(fù)合樹(shù)脂為空白對(duì)照組，聚乙烯薄膜為陽(yáng)性對(duì)照組。按上述比例將抗菌劑添加到復(fù)合樹(shù)脂的粉劑中，手工混勻后按7∶3的粉液比進(jìn)行調(diào)拌，充填于內(nèi)徑10 mm、厚2 mm的聚四氟乙烯模具中，覆蓋聚乙烯薄膜，并用玻璃板加壓。每組3個(gè)試件，均新鮮使用，并于實(shí)驗(yàn)前用70%乙醇溶液擦拭樣品表面，1 min后用無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌環(huán)境下干燥備用。將陽(yáng)性對(duì)照組的聚乙烯薄膜制備成直徑為10 mm的圓片，紫外光消毒2 h后備用。

1.3.2  樣本的抗菌率檢測(cè)  將樣本置于無(wú)菌瓊脂   平板上，稍加壓使樣品嵌入瓊脂中，并保持其上表面高于瓊脂平面，以固定樣品，防止其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中移動(dòng)。制備濃度約為1×106 CFU/mL的菌懸液，分別取15 μL滴加在樣品表面（陽(yáng)性對(duì)照組將菌液加于聚乙烯薄膜上），覆蓋聚乙烯薄膜，鋪平，使細(xì)菌均勻接觸樣品，同時(shí)防止菌液揮發(fā)[5]。37 ℃厭氧孵育24 h后用無(wú)菌生理鹽水充分洗脫附于樣本及覆蓋膜表面的細(xì)菌?；靹蛳疵撘?，倍比稀釋后取100 μL接種至BHI瓊脂平板上，厭氧孵育24～48h后行菌落計(jì)數(shù)。以平板上菌落數(shù)為30～300的平板為準(zhǔn)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品及對(duì)照組的回收菌數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。將測(cè)定的菌落數(shù)按如下公式計(jì)算抗細(xì)菌率：r（%）=（b－c）/b×100％。r為抗細(xì)菌率（%）；b為空白對(duì)照樣品平均回收菌數(shù)；c為添加抗菌劑的樹(shù)脂樣品平均回收菌數(shù)。

1.3.3  抗菌長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)  實(shí)驗(yàn)分組同1.3.1，每組制備3個(gè)試樣，消毒后浸泡于2 mL無(wú)菌人工唾液中。所有試樣在37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)老化處理3個(gè)月，每3 d更換1次人工唾液。抗菌率的測(cè)試同1.3.2。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與未經(jīng)老化處理的試件相比較。

1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 

抗菌率及長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用 SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析及組間SNK-q檢驗(yàn)。

2  結(jié)果

納米級(jí)ZnO粉、T-ZnOw、微米級(jí)ZnO粉對(duì)變異鏈球菌的MIC分別為78.13、312.50、1 250.00 μg/mL；MBC分別為156.25、625.00、1 250.00 μg/mL。抗菌率及長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組未表現(xiàn)出任何抗菌作用。添加了納米級(jí)ZnO粉、T-ZnOw、微米級(jí)ZnO粉的樣本老化前抗菌率為（93.58±5.95）％、（89.42±4.11）％、（78.97±3.90）％。添加了微米級(jí)ZnO粉的復(fù)合樹(shù)脂抗菌率較低，與其他2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。老化后3組復(fù)合樹(shù)脂的抗菌率為（89.01±7.91）％、 （84.63±4.72）％、（72.27±3.89）％，與老化前的抗菌率相比，添加了微米級(jí)ZnO粉的復(fù)合樹(shù)脂抗菌率下降明顯（P＜0.05）。

3  討論

復(fù)合樹(shù)脂因其自身理化性質(zhì)的制約及聚合收縮而可能引起的微滲漏、繼發(fā)齲等問(wèn)題影響了復(fù)合樹(shù)脂的臨床修復(fù)效果。在盡量減小其聚合收縮的同時(shí)如何使復(fù)合樹(shù)脂具有抗菌性成為解決這一問(wèn)題的另一條途徑。無(wú)機(jī)抗菌材料ZnO既克服了有機(jī)抗菌劑耐熱性差、抗菌壽命短、易耐藥等缺點(diǎn)，又避免了銀系抗菌劑易變色的不足，同時(shí)還無(wú)需光照，是應(yīng)用于口腔修復(fù)材料抗菌的理想選擇。

ZnO的抗菌機(jī)制還不是很明了，有學(xué)者[6-7]認(rèn)為過(guò)氧化氫的產(chǎn)生是ZnO抗菌機(jī)制的主要因素，細(xì)菌的細(xì)胞膜對(duì)過(guò)氧化氫是可滲透的，從而引起細(xì)菌的某些損傷以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)或殺死細(xì)菌。為了更有效地利用ZnO表面產(chǎn)生的過(guò)氧化氫來(lái)抗菌，發(fā)明了以活性炭為載體的納米ZnO，同時(shí)還闡明ZnO的抗菌活性與其粒徑大小、比表面積及結(jié)晶度有關(guān)[6，8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米級(jí)ZnO對(duì)變異鏈球菌的抗菌性最強(qiáng)，而微米級(jí)ZnO作用最弱，這可能與ZnO的粒徑及比表面積有關(guān)。因?yàn)槲⒚准?jí)ZnO粒徑為0.3～0.5 μm，比表面積為7.02 m2/g；而納米級(jí)ZnO的粒徑為80～120 nm，比表面積達(dá)到了25.7 m2/g。隨著ZnO粒徑的減小，比表面積增大，單位體積的ZnO顆粒量增加，釋放的過(guò)氧化氫濃度隨之增高，表現(xiàn)出更好的抗菌作用[8]。另外也有可能因?yàn)榧{米ZnO具有較大的比表面積和較高的表面能，因而對(duì)細(xì)菌具有更強(qiáng)的吸附作用，從而表現(xiàn)出更好的抗菌效能。

T-ZnOw是一種新型材料，它具有一種空間正四面體構(gòu)型，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有三維立體結(jié)構(gòu)的晶須，并表現(xiàn)出多種獨(dú)特功能和用途。其獨(dú)有的外形、獨(dú)特的功能及其在廣譜抗菌的同時(shí)又能增強(qiáng)材料的特點(diǎn)使其成為目前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中使用的T-ZnOw針徑為0.5～2.5 μm，針長(zhǎng)為25～100 μm，比表面積為7.74 m2/g。雖然它與微米級(jí)ZnO的比表面積近似，但卻表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌作用，這可能與其獨(dú)特的四針狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。一方面T-ZnOw的針徑及針長(zhǎng)雖都是微米級(jí)，但其尖端相當(dāng)部分在納米量級(jí)，從而具有納米材料所具備的特殊的表面效應(yīng)和高活性；另一方面T-ZnOw因其獨(dú)特的四針狀結(jié)構(gòu)，分散后可形成立體導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為抗菌離子提供高效傳輸途徑[9]。

本研究結(jié)果表明，添加了納米級(jí)ZnO和T-ZnOw的復(fù)合樹(shù)脂均具有較強(qiáng)的抗菌作用；添加了微米級(jí)ZnO的復(fù)合樹(shù)脂抗菌作用較差，與其他2組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這雖然與所測(cè)的MIC、MBC結(jié)果相同，但是納米ZnO組的抗菌率卻并未達(dá)到預(yù)計(jì)水平，這可能與納米材料較易團(tuán)聚有關(guān)。因?yàn)楸砻嫣幚磉^(guò)程可能會(huì)對(duì)ZnO抗菌性能產(chǎn)生影響，所以本實(shí)驗(yàn)中各組抗菌劑均未經(jīng)表面處理。由于納米ZnO顆粒表面能較高，在與有機(jī)材料混和時(shí)，易發(fā)生團(tuán)聚，難以實(shí)現(xiàn)均勻分布，從而使其抗菌性的發(fā)揮受到影響。而T-ZnOw雖然比表面積較小，但T-ZnOw可在材料內(nèi)部形成立體導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，晶須間互相聯(lián)系，不僅試件表面晶須發(fā)揮抗菌作用更能動(dòng)員試件內(nèi)部晶須共同作用，從而大大提高了其抗菌效果，同時(shí)晶須尖端有納米活性抗菌作用，并且針尖部位不會(huì)產(chǎn)生團(tuán)聚，是真正意義的可分散的納米材料，從而有利于其抗菌活性的發(fā)揮[9]。此外，

T-ZnOw的四針狀結(jié)構(gòu)及高強(qiáng)度高模量性質(zhì)，使其易在材料中獲得均勻分布并對(duì)材料具有較強(qiáng)的增強(qiáng)增韌作用，未經(jīng)偶聯(lián)處理時(shí)，在少量添加的情況下應(yīng)該不會(huì)對(duì)樹(shù)脂的機(jī)械性能產(chǎn)生較大的影響，這也是納米及微米ZnO所不具備的優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)添加3種ZnO對(duì)復(fù)合樹(shù)脂機(jī)械性能的影響及表面處理過(guò)程對(duì)ZnO抗菌作用及復(fù)合材料機(jī)械性能的影響仍需進(jìn)一步研究。

老化前后的抗菌率相比，添加了納米級(jí)ZnO及T-ZnOw的樣本均表現(xiàn)出較好的抗菌長(zhǎng)效性，且二者與添加了微米級(jí)ZnO的樣本間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這可能與微米ZnO比表面積較小，樹(shù)脂基質(zhì)對(duì)其包埋固定效果不好有關(guān)，也可能因?yàn)槠淞脚c復(fù)合樹(shù)脂填料粒徑（1～5 μm）不匹配，從而增大了填料的孔隙率及材料的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致了ZnO溶出增多，樹(shù)脂抗菌效果下降明顯。

來(lái)源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》